|
|
Charakterizace vybraných bakteriálních kmenů získaných během evolučních experimentů
Hrabalová, Vendula ; Sedláček, Petr (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce se zabývá použitím evolučního inženýrství na bakteriální kmeny produkující polyhydroxyalkanoáty (PHA). Cílem této práce byla charakterizace adaptovaných bakteriálních kmenů na vybrané selekční tlaky. Pro evoluční experimenty byly vybrány dvě bakterie, Cupriavidus necator H16 a Halomonas halophila. Selekční tlaky, kterými se působilo na bakterie byly měďnaté kationty (Cu2+) a chlorid sodný (NaCl) pro C. necator H16, a kyselina octová (AA) a levulová (LA) pro H. halophila. Adaptované kmeny byly v průběhu dlouhodobých evolučních experimentů charakterizovány co do obsahu PHA a jeho Mw pomocí analýz GC-FID a SEC-MALS. Dále byl studován růst jednotlivých adaptovaných kmenů měřením optické hustoty. Pomocí spektrálního FC byla následně změřena procenta živých buněk po vystavení bakterií vybraným stresovým faktorům. Byly stanoveny specifické enzymové aktivity vybraných enzymů citrátového a glyoxalátového cyklu, enzymů generujících NADPH, enzymu zapojeného do metabolismu LA a enzymů biosyntézy PHA. U všech experimentů byly adaptované kmeny porovnávány s kmeny divokými. Optimální adaptace se projevila u bakterie C. necator H16 na Cu2+. Bakterie H. halophila byla na závěr kultivována v hydrolyzátu z lignocelulózových odpadů, kdy bylo zjištěno, že adaptovaný kmen H. halophila na LA je schopen produkovat více PHA než kmen původní.
|
|
|
Biotechnologická produkce PHA pomocí vybraných bakteriálních isolátů
Matějka, Filip ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce pojednává o produkci polyhydroxyalkanoátů (PHA) za využití termofilních bakteriálních izolátů s označením 34, 35 a BŽ. Bakteriální mikroorganismy pocházejí z aktivovaného kalu a kompostu. Teoretická část práce obsahuje popis PHA, extremofilních bakterií a detekčních technik pro stanovení polyhydroxyalkanoátů. V experimentální části byla nejprve pomocí PCR stanovena přítomnost phaC genu, který je klíčový pro schopnost produkce PHA a bakteriální kmeny byly také podrobeny sekvenaci genu 16S rRNA za účelem jejich taxonomické klasifikace. V další části experimentální práce došlo k optimalizaci podmínek pro nárůst biomasy a produkci PHA. Postupně byly identifikovány vhodného zdroje uhlíku, ideální kultivační teplota a taktéž byl sledován vliv prekurzorů na produkci kopolymerů. Složení a podíl PHA byl stanoven pomocí GC-FID a na závěr proběhl vizuální screening akumulace PHA uvnitř bakteriálních buněk za pomocí fluorescenční mikroskopie.
|
|
|
Vliv schopnosti akumulace PHA na odolnost bakterií vůči bakteriocidním léčivům
Hrabalová, Vendula ; Kučera, Dan (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá vlivem bakteriocidních léčiv na bakterii kmene C. necator H16 a jejímu mutantnímu kmenu PHB-4. Kmen H16 je schopen akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA) ve formě granulí, zatímco kmen PHB-4 tuto schopnost postrádá. Teoretická část bakalářské práce se zaměřuje na vliv antibiotik na bakterie obecně a možností stanovení citlivosti mikroorganismů vůči antimikrobiálním látkám. V experimentální části byl testován vliv tří vybraných antibiotik (nisin, streptomycin a penicilin) na oba kmeny. Stanovena byla viabilita bakterií pomocí plotnové metody a průtokového cytometru. Dále byly použity antimikrobiální testy, konkrétně agarová difúzní metoda a bujónová diluční metoda. Ukázalo se, že produkce PHA snižuje odolnost buněk vůči antimikrobiálním látkám, protože kmen C. necator H16 je citlivější vůči působení streptomycinu a penicilinu než kmen C. necator PHB-4.
|
|
|
Adaptation to adverse osmotic conditions as a tool for evolutionary enginnering of bacteria
Drotárová, Lenka ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
This bachelor thesis deals with the application of osmotic stress as a tool for evolutionary engineering of PHA producing bacterial strains. The aim of this thesis is to evaluate a bacterial adaptation to hypoosmotic environment, as an engineering tool in order to increase the production of PHA. The theoretical part focuses on the evolutionary engineering principle, methods of the strategy and the effect of physical factors on microorganism. The aim of experimental part was to performed an adaptive evolutionary experiment with the bacterial strain Halomonas halophila CCM 3662. Reduced osmotic pressure was used as a stressing factor during the serial cultivation. In order to generate PHA producing mutant strains, each passage was characterized using spectrophotometric and gravimetric method and by GC-FID. It was found that after the long-term cultivation, the mutant strain HH35, cultivated in 35 g/l NaCl, was associated with the highest biomass and PHB concentration. The 15th and 30th passages, along with the wild type strain H. halophila were subjected to further cell-robustness analysis with the application of hyper- and hypoosmotic shock. The stress response, viability of cells and morphological changes were analyzed using FC and TGA methods. Isolated polymers were characterized using FTIR analysis.
|
|
|
Biodegradabilita přirozených a modifikovaných polyesterů bakteriálního původu a jejich kompozitů
Pala, Martin ; Babák, Libor (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená práce se zabývala studiem biodegradability přirozených a modifikovaných polyesterů bakteriálního původu a jejich kompozitů. První část práce byla zaměřena na studium vlivu struktury PHA granulí na jejich biodegradabilitu pomocí vybraných enzymů a vliv fyziologických podmínek na stabilitu PHA. Celkově se zdá, že testovaný polymer, ať už v krystalické nebo amorfní formě je rezistentní vůči ataku použitých hydrolytických enzymů jako jsou lipáza nebo proteáza a je stabilní v simulovaných fyziologických prostředích. Díky tomu je možné uvažovat o využití PHA materiálů v biomedicínských aplikacích jako jsou například implantáty, které vyžadující spíše rezistentní materiály. Druhá část práce se zabývala mikrobiální degradací modifikovaných PHA materiálů s ohledem na jejich možný environmentální dopad. Na biodegradaci byla použita směsná termofilní kultura používáná v čističce odpadních vod a bakterie Delftia acidovorans. Byla testována biodegradabilita kompozitů obsahujících chlorovaný PHB a PHB fólií modifikovaných pomocí plastifikátorů. S rostoucím obsahem chlorovaného materiálu fólie vykazovaly spíše inhibiční efekt na růst biomasy obou testovaných kultur. Nejyšší míra degradace byla zaznamenána v přitomnosti bakteriální kultury u fólie obsahující 10% chlorovaného PHB (31%). Z výsledků lze konstatovat, že důležitým faktorem ovlivňující biodegradabilitu materiálů je použitá mikrobiální populace.
|
|
|
Využití bakterie Tepidimonas taiwanensis k produkci polyhydroxyalkanoátů na odpadních substrátech
Vidláková, Michaela ; Pernicová, Iva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce je zaměřena na screening produkce PHA pomocí termofilní bakterie Tepidimonas taiwanensis a na studium možného využití hroznových výlisků, melasy a odpadního papíru jako levných uhlíkatých substrátů pro kultivace charakterizované bakterie. Nejprve bylo provedeno testování základních kultivačních parametrů zahrnujících koncentraci uhlíkatého substrátu, dostupnost kyslíku, schopnost utilizace zdrojů dusíku a vybraných disacharidů. Produkce PHA z odpadních substrátů byla testována třemi způsoby. Při prvním byly jako zdroj uhlíku použity předem připravené hydrolyzáty z odpadních surovin zbavené pevného podílu. Druhý a třetí postup byl proveden nadávkováním odpadních materiálů přímo do minerálních médií, která se lišila pouze přítomností a absencí enzymového preparátu umožňujícím enzymatickou hydrolýzu dané suroviny za vzniku fermentovatelných sacharidů. Nejintenzivnější nárůst kultury a nejvyšší produkce PHA byla zaznamenána na hydrolyzátu z hroznových výlisků. Koncentrace biomasy u tohoto vzorku dosahovala až 4,8 g/l s obsahem 59 % PHA. Přídavek hroznových výlisků přímo do produkčního média se naopak vůbec neosvědčil, což bylo pravděpodobně způsobeno přítomností velkého množství inhibičních látek z výlisků. Podobně tomu bylo i u melasy a odpadního papíru, kdy byla bakterie Tepidimonas taiwanensis schopna růstu a případné produkce PHA pouze v malé míře. V rámci práce se podařilo také charakterizovat vliv teploty a pH na aktivitu enzymového koktejlu Viscozyme L a určit teplotní a pH optimum PHA syntázy bakteriálního kmene Tepidimonas taiwanensis v buněčném lyzátu.
|
|
|
Stresová odolnost PHA akumulujících bakterií vůči podmínkám v gastrointestinálním traktu
Kovářová, Radka ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá stresovou odolností bakterií produkující PHA vůči nepříznivým podmínkám v gastrointestinálním traktu. Za tímto účelem byly zvoleny dva bakteriální kmeny jako modelové mikroorganismy. Cupriavidus necator H16 produkující PHA a její mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4 bez schopnosti akumulace PHA. Pro experimentální část byly nejprve vybrány tři šťávy o různých koncentracích, konkrétně žaludeční, žlučová a pankreatická. Dále byla stanovována viabilita stresovaného bakteriálního kmene pomocí plotnové metody a průtokového cytometru. Mezi další využité metody patří antimikrobiální testy. První z těchto testů byla použita agarová difúzní metoda, díky které byly stanoveny a porovnány velikosti inhibičních zón. Poslední metoda, která byla provedena, je bujónová diluční metoda, sloužící k porovnání absorbancí čistých bakteriálních suspenzí a stresovaných suspenzích s danou šťávou o určité koncentraci. Z výsledků je patrné, že produkce PHA představuje v kontextu expozice stresovým podmínkám gastrointestinálního traktu především nevýhodu pro akumulující bakteriální kmen.
|
|
|
Využití PHA produkujících kmenů v bioremediačních technologiích
Šuráňová, Zuzana ; Sedláček, Petr (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem diplomové práce bylo studium využití PHA produkujících kmenů v bioremediačních technologiích. Pro tuto studii byly vybrány bakterie Pseudomonas putida KT2440 a dva izoláty z půdy zamořené ropou - Pseudomonas gessardii (D2) a Pseudomonas fulva (D3). V experimentální části byla studována především biodegradace odpadního peří pomocí testovaných mikrobiálních kmenů. Všechny testované bakterie vykazovaly biodegradační aktivitu vůči peří a byly jej schopny utilizovat jako jediný zdroj uhlíku. V průběhu biodegradačního procesu byl monitorován hmotnostní úbytek peří, aktivita proteáz a keratináz, koncentrace bakteriální biomasy, obsah PHA a také pH. Ukázalo se, že nejvyšších keratinázových aktivit i stupně degradace peří bylo dosaženo u bakterie Pseudomonas putida. Při kultivaci na odpadním peří žádná z testovaných bakterií neakumulovala detekovatelné množství PHA, nicméně biomasu nakultivovanou při biodegradaci peří je možné využít jako inokulum pro biotechnologickou výrobu MCL-PHA na odpadním oleji a kyselině oktanové. U bakterie Pseudomonas putida bylo v tomto experimentálním schématu dosaženo vysokého obsahu MCL-PHA v biomase - téměř 54% suché hmoty biomasy. V další části práce byla studována biodegradace nafty, ze studovaných bakteriálních kmenů bylo nejvyššího růstu biomasy, a tedy i biodegradačního potenciálu dosaženo u bakterie Pseudomonas fulva.
|
|
|
Evoluční inženýrství bakterií produkujících polyhydroxyalkanoáty
Nováčková, Ivana ; Kovalčík, Adriána (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá aplikací evolučního inženýrství na PHA produkující kmeny. Cílem práce je připravit prostřednictvím metod evolučního inženýrství kmeny adaptované na kyselinu levulovou, jakožto vybraný stresový faktor, a následně tyto kmeny charakterizovat. Teoretická část práce se zabývá především evolučním inženýrstvím a polyhydroxyalkanoáty. Pro evoluční experimenty byl využit bakteriální kmen Cupriavidus necator H16. Za účelem přípravy adaptovaných kmenů byla aplikována jednak samotná kyselina levulová, jednak kyselina levulová v přítomnosti mutagenu MMS. Selekce vhodných mutantů byla posuzována na základě růstového potenciálu a obsahu PHA v biomase. U pěti získaných PHA produkujících adaptovaných mutantů a kontroly byly prostřednictvím metod GC-FID, SEC-MALS, DSC a FT-IR charakterizovány vyizolované polymery. Bylo zjištěno, že vyšší obsah 3HV v kopolymeru vedl k nižší krystalinitě a tím i k nižší teplotě tání, z trendu se vymykal pouze kopolymer kmene M0151. Kromě charakteristik polymerů byly z biochemického hlediska posuzovány i samotné kmeny, a to prostřednictvím stanovování aktivit vybraných enzymů citrátového, glyoxalátového a 2-methylcitrátového cyklu, vybraných enzymů generujících NADPH, enzymu katabolismu kyseliny levulové a enzymů biosyntézy PHA. Na základě získaných dat byly diskutovány možné adaptační strategie, kdy se nejvíce odlišovat kmen E0575. Hodnoty specifických enzymových aktivit byly podrobeny metodám statistické analýzy AHC a PCA.
|
|
|
Studium akumulace polyhydroxyalkanoátů u cyanobakterií
Pacasová, Viktorie-Alexandra ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená bakalářská práce je zaměřená na studium vlivu vybraných stresových faktorů na produkci PHB u kmenů cyanobakterií Synechocystis sp. PCC 6803 a Synechocystis salina CCALA 192. Cyanobakterie byly kultivovány v multikultivátoru a jako stresový faktor byl použit zvýšený obsah soli (chloridu sodného) nebo směs acetátu a -butyrolaktonu v kultivačním médiu. Obsah PHB v jednotlivých cyanobakteriích byl stanovován pomocí plynové chromatografie, přítomnost a množství barviv byla stanovována pomocí extrakce barviv a pomocí přímé spektrofotometrické analýzy. Získané výsledky nepotvrdily hypotézu o zvýšení produkce PHB při kultivaci cyanobakterií v prostředí se zvýšeným obsahem soli. Příčinou tohoto zjištění je pravděpodobně společné působení několika stresových faktorů jako zvýšený obsah soli, kontinuální osvětlení v multikultivátoru a limitace dusíkem, díky použitému typu média, na kultury Synechocystis salina CCALA. Při kultivaci se směsí acetátu a -butyrolaktonu byly kultury analyzovány stejným způsobem, jako v případě prostředí se zvýšeným obsahem soli, a byla stanovována i přítomnost kopolymeru 3-hydroxybutyrátu a 4-hydroxybutyrátu. Během této kultivace byl rovněž pozorován pozitivní vliv kombinace působení kontinuálního osvětlení, typu média limitujícího dusík a výchozí koncentrace buněk v kulturách na rychlost růstu vybraných kmenů cyanobakterií.
|
host ::
RSS.